Confronto tra le linee guida nuove e precedenti per il test di tossicità acuta sui lombrichi

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Non applicabile ai pesticidi chimici volatili e scarsamente solubili.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Non applicabile ai pesticidi volatili. La restrizione relativa alle sostanze "scarsamente solubili" è stata rimossa, ampliando l'ambito delle sostanze sottoponibili a prova.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Nessuno.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): È stato aggiunto un Capitolo 2 dedicato ai riferimenti normativi, che cita norme di supporto fondamentali, tra cui GB/T 6682 (acqua per uso nei laboratori analitici), NY/T 52 (determinazione del suolo), NY/T 1121.2 (determinazione del pH del suolo) e NY/T 4195.8 (coltivazione di organismi biologici da prova).

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Includeva le definizioni di clitello, lombrico adulto, concentrazione letale mediana, sostanza sottoposta a prova e pesticida chimico.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Sono state rimosse le definizioni di clitello, lombrico adulto, sostanza sottoposta a prova e pesticida chimico. È mantenuto esclusivamente il termine fondamentale: concentrazione letale mediana (LC50).

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Temperatura: 20°C ± 2°C; umidità relativa: da 70% a 90%; intensità luminosa: da 400 lx a 800 lx.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): È stato eliminato il requisito relativo all'umidità di prova, aumentando la flessibilità operativa. La temperatura rimane pari a 20°C ± 2°C e l'intensità luminosa rimane compresa tra 400 lx e 800 lx.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Nessuno.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): È stato aggiunto un elenco dettagliato dei reagenti, comprendente acetone, n-esano, sabbia quarzifera, argilla caolinica, carbonato di calcio, cloroacetamide e altri, fornendo indicazioni chiare sulle sostanze chimiche e sui materiali richiesti.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Si raccomandava di selezionare lombrichi adulti Denominazione: Eisenia fetida per la prova, con un peso corporeo compreso tra 0.30 g e 0.60 g.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Specifica l'uso di Denominazione: Eisenia fetida. Devono essere utilizzati lombrichi adulti sani di età superiore a 2 mesi, con clitello sviluppato (sessualmente maturi) e un peso corporeo compreso tra 300 mg e 600 mg. La coltivazione di Denominazione: Eisenia fetida deve essere conforme alla norma NY/T 4195.8, che stabilisce condizioni di allevamento standardizzate.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Elencava solo le apparecchiature principali: incubatore, contenitori di vetro e matracci tarati.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Fornisce un elenco completo delle apparecchiature con specifiche di precisione: capsule o becher per cristallizzazione, camere ambientali o locali a temperatura costante, apparecchiature per la miscelazione o l'omogeneizzazione, bilance elettroniche (risoluzione: 0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g), bilance elettroniche (risoluzione: 0.1 g), termoigrometro o registratori di temperatura/umidità, pHmetro, stufa e luxmetro.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): La sostanza sottoposta a prova doveva essere costituita da formulati pesticidi, sostanze tecniche o sostanze pure. Per le sostanze scarsamente solubili in acqua, poteva essere utilizzata come co-solvente una piccola quantità di solvente organico a bassa tossicità per i lombrichi, generalmente non superiore a 0.1 mL(g)/L.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): La sostanza sottoposta a prova deve essere costituita da sostanze tecniche (concentrati tecnici), formulati o sostanze pure. Prima della prova, devono essere acquisite informazioni sulla solubilità della sostanza sottoposta a prova in acqua e nei solventi organici, sulla stabilità in acqua e nel suolo, sulla stabilità alla fotolisi, sulla pressione di vapore satura, sulla purezza, sul coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua e sui risultati della prova di biodegradabilità pronta. Ciò riflette una maggiore enfasi sulla caratterizzazione preliminare alla prova.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Alle stesse condizioni della prova definitiva, impostare diversi gruppi di concentrazione con intervalli ampi per determinare la concentrazione minima che causa 100% mortalità e la concentrazione massima che causa 0% mortalità dei lombrichi. Le concentrazioni per la prova definitiva devono essere impostate entro tale intervallo.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Impostare i gruppi di trattamento utilizzando una serie geometrica. Eseguire la prova di ricerca dell'intervallo alle stesse condizioni della prova definitiva per determinare l'intervallo di concentrazione della prova definitiva. Non sono necessarie repliche per la prova di ricerca dell'intervallo, semplificando la fase di prova preliminare.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Impostare la concentrazione limite superiore a 100 mg di sostanza attiva/kg di suolo secco. Se non si osserva mortalità dei lombrichi, non sono necessarie ulteriori prove.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Impostare la concentrazione limite superiore a 1,000 mg di sostanza sottoposta a prova/kg di suolo secco. Se il tasso di mortalità dei lombrichi non è superiore a 10%, non è necessaria alcuna prova definitiva. La soglia più elevata riduce le prove non necessarie per le sostanze a bassa tossicità.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Impostare da 5 a 7 gruppi di concentrazione entro l'intervallo determinato dalla prova di ricerca dell'intervallo, oltre a un gruppo di controllo non trattato. Se viene utilizzato un solvente organico, deve essere aggiunto anche un gruppo di controllo del solvente. 3 repliche per ciascun gruppo di concentrazione.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Sulla base dei risultati della prova di ricerca dell'intervallo o dei dati di tossicità noti, impostare da 5 a 7 concentrazioni di trattamento utilizzando una serie geometrica, con un gruppo di controllo non trattato e, se applicabile, un gruppo di controllo del solvente. Ciascun gruppo deve avere 4 repliche (rispetto alle 3 precedenti), con 10 lombrichi collocati in ciascuna replica.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Nessuna (non è specificata alcuna procedura di preparazione specifica).

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Prima del test, i lombrichi destinati al test devono essere mantenuti nel suolo artificiale per 24 ore alle stesse condizioni del test definitivo. Lavare accuratamente i lombrichi e asciugarli tamponandoli con carta da filtro prima di pesarli. Questa fase di acclimatazione migliora la coerenza del test.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Porre 500 g di suolo in un contenitore di vetro (profondità del suolo ≥ 8 cm). Aggiungere la soluzione della sostanza da testare e miscelare accuratamente. Se si utilizza un solvente organico, questo deve essere completamente evaporato. Regolare l’umidità del suolo a 30%–35% del peso del suolo secco. Per le sostanze scarsamente solubili in acqua, è possibile utilizzare una piccola quantità di solvente organico (≤ 0.1 mL(g)/L).

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Prevede tre distinti metodi di applicazione in base alla solubilità:

   (1) Per solubili in acqua sostanze da testare: preparare la soluzione di prova con acqua e miscelarla accuratamente con il suolo artificiale.
   (2) Per solubili in solventi organici sostanze: sciogliere in n-esano o acetone, aggiungere goccia a goccia a 10 g di sabbia di quarzo. Dopo la completa evaporazione del solvente, miscelare con il suolo artificiale preinumidito e aggiungere acqua deionizzata fino a raggiungere 750 g di peso umido.
   (3) Per le sostanze insolubili sia in acqua sia nei solventi organici: miscelare con sabbia di quarzo fino a un totale di 10 g, quindi miscelare con il suolo artificiale preinumidito e aggiungere acqua deionizzata fino a 750 g di peso umido.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Porre 500 g di suolo in un contenitore di vetro (profondità del suolo ≥ 8 cm).

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Aggiungere 750 g di peso umido di suolo artificiale trattato in un contenitore di vetro, con una profondità del suolo non inferiore a 8 cm. Il "peso umido" specificato sostituisce la precedente misurazione basata sul peso secco.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Pesare una volta all’inizio del test — peso corporeo compreso tra 0.30 g e 0.60 g.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Pesare due volte: una all’inizio del test (peso corporeo compreso tra 0.30 g e 0.60 g) e una alla fine del test per i lombrichi sopravvissuti. 

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Aggiungere acqua deionizzata per regolare l’umidità del suolo a 30%–35% del peso del suolo secco.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Se necessario, aggiungere acqua per regolare l’umidità del suolo a circa 35% del peso del suolo secco. Il contenuto di umidità del suolo deve essere determinato in conformità alla norma NY/T 52, stabilendo un metodo di misurazione standardizzato.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Il test dura due settimane. Nei giorni 7 e 14, rovesciare il suolo, osservare e registrare i sintomi di avvelenamento e i lombrichi morti (toccare l’estremità posteriore con un ago; nessuna risposta = morto), rimuovendo immediatamente i lombrichi morti. Calcolare l’LC50 e i limiti di confidenza 95% sulla base dei tassi di mortalità nei giorni 7 e 14.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Il periodo di test rimane di 14 giorni. I principali perfezionamenti includono:
   - Illuminazione continua è fornita per garantire che i lombrichi rimangano nel suolo artificiale.
   - Reintegro periodico dell’acqua mediante pesatura per mantenere l’umidità del suolo.
   - Metodo di osservazione: Versare delicatamente il suolo su un piatto o una capsula di vetro; prelevare i lombrichi per esaminarli.
   - Criterio di morte: I lombrichi sono considerati morti quando non mostrano alcuna risposta dell’estremità anteriore a uno stimolo meccanico (modificato rispetto all’estremità posteriore).
   - Dopo l’esame del giorno 7, restituire i lombrichi sopravvissuti e il suolo artificiale nel contenitore per proseguire il test.
   - Al termine del test, pesare i lombrichi sopravvissuti e determinare il contenuto di umidità del suolo artificiale.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): L’LC50 e i limiti di confidenza 95% per ciascun tempo di osservazione possono essere calcolati utilizzando il metodo di Spearman-Kärber, il metodo dell’interpolazione lineare o il metodo grafico dell’analisi probit. È inoltre possibile utilizzare software pertinenti per il calcolo dei dati di tossicità.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Selezionare metodi statistici quali il metodo probit o il metodo della regressione logistica per calcolare l’LC50 e il relativo intervallo di confidenza 95% (ad eccezione del test limite). È possibile utilizzare software statistici appropriati. Quando i tassi di mortalità sono 0% e 100% a due concentrazioni consecutive con un rapporto geometrico ≤ 2.0, utilizzare la loro media geometrica come LC50. Ciò fornisce indicazioni statistiche più chiare ed elimina le ambiguità relative ai casi limite.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): La mortalità nel gruppo di controllo non trattato non deve superare 10%.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): La mortalità nel gruppo di controllo non trattato e nel gruppo di controllo del solvente non deve superare 10%. L’inclusione esplicita del gruppo di controllo del solvente nei criteri di controllo qualità garantisce un monitoraggio adeguato degli eventuali effetti correlati al solvente.

Versione precedente (GB/T 31270.15-2014): Requisiti di base per la rendicontazione.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): Il contenuto del rapporto è più dettagliato e standardizzato e comprende le condizioni del test, i dati grezzi, i metodi statistici e ulteriori parametri di qualità. Ciò è in linea con le pratiche GLP internazionali e migliora la trasparenza dei dati.

Vecchia versione (GB/T 31270.15-2014): L'Appendice A forniva i componenti e le proporzioni del suolo artificiale.

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): È stato aggiunto il metodo di preparazione del suolo artificiale, oltre ai componenti e alle proporzioni, fornendo un protocollo completo, passo dopo passo, per una preparazione uniforme del suolo tra i laboratori.

Vecchia versione (GB/T 31270.15-2014): L'Appendice B specificava quattro livelli di tossicità basati su LC50 (14d) / (mg s.a./kg di suolo secco):

• Estremamente tossico: LC50 ≤ 0.1

• Altamente tossico: 0.1 < LC50 ≤ 1.0

• Moderatamente tossico: 1.0 < LC50 ≤ 10

• Leggermente tossico: LC50 > 10

Nuova versione (GB/T 31270.15-2025): È stata rimossa l'appendice sulla classificazione della tossicità.