So sánh hướng dẫn mới và cũ về thử nghiệm độc tính cấp tính trên giun đất

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Không áp dụng cho thuốc bảo vệ thực vật hóa học dễ bay hơi và ít tan.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Không áp dụng cho thuốc bảo vệ thực vật dễ bay hơi. Hạn chế «ít tan» được bỏ, mở rộng phạm vi các chất có thể thử nghiệm.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Không có.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Thêm Chương 2 riêng về tài liệu viện dẫn, dẫn các tiêu chuẩn hỗ trợ chính như GB/T 6682 (nước dùng trong phòng thí nghiệm phân tích), NY/T 52 (xác định chỉ tiêu đất), NY/T 1121.2 (xác định pH đất) và NY/T 4195.8 (nuôi sinh vật thử nghiệm).

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Có định nghĩa đai sinh dục, giun đất trưởng thành, nồng độ gây chết trung vị, chất thử và thuốc bảo vệ thực vật hóa học.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Bỏ định nghĩa đai sinh dục, giun đất trưởng thành, chất thử và thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Chỉ giữ thuật ngữ cốt lõi: nồng độ gây chết trung vị (LC50).

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Nhiệt độ: 20°C ± 2°C; độ ẩm tương đối: 70% đến 90%; cường độ ánh sáng: 400 lx đến 800 lx.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Bỏ yêu cầu độ ẩm không khí trong thử nghiệm, tăng tính linh hoạt thao tác. Nhiệt độ vẫn là 20°C ± 2°C và cường độ ánh sáng vẫn là 400 lx đến 800 lx.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Không có.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Thêm danh mục thuốc thử chi tiết gồm acetone, n-hexane, cát thạch anh, đất sét kaolin, calcium carbonate, chloroacetamide và chất khác, làm rõ hóa chất và vật liệu cần thiết.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Khuyến nghị chọn giun trưởng thành thuộc loài Eisenia fetida để thử nghiệm, có khối lượng cơ thể từ 0.30 g đến 0.60 g.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Quy định sử dụng loài Eisenia fetida. Cần dùng giun trưởng thành khỏe mạnh trên 2 tháng tuổi, có đai sinh dục phát triển (thành thục sinh dục), khối lượng từ 300 mg đến 600 mg. Việc nuôi giun thuộc loài Eisenia fetida phải tuân thủ NY/T 4195.8 để chuẩn hóa điều kiện nuôi.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Chỉ liệt kê dụng cụ chính: tủ ấm, bình chứa bằng thủy tinh và bình định mức.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Cung cấp danh mục thiết bị toàn diện với yêu cầu độ chính xác: đĩa kết tinh hoặc cốc thủy tinh, buồng môi trường hoặc phòng nhiệt độ không đổi, thiết bị trộn hoặc phối trộn, cân điện tử (độ đọc: 0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g), cân điện tử (độ đọc: 0.1 g), nhiệt ẩm kế hoặc máy ghi nhiệt độ/độ ẩm, máy đo pH, tủ sấy và máy đo độ rọi.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Chất thử nên là chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật, nguyên liệu kỹ thuật hoặc chất tinh khiết. Với chất ít tan trong nước, có thể dùng một lượng nhỏ dung môi hữu cơ ít độc với giun đất làm dung môi hỗ trợ, thường không quá 0.1 mL(g)/L.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Chất thử phải là nguyên liệu kỹ thuật (chất cô đặc kỹ thuật), chế phẩm hoặc chất tinh khiết. Trước thử nghiệm cần có thông tin về độ tan trong nước và dung môi hữu cơ, độ ổn định trong nước và đất, độ ổn định quang phân, áp suất hơi bão hòa, độ tinh khiết, hệ số phân bố n-octanol/nước và kết quả thử nghiệm khả năng phân hủy sinh học dễ dàng. Điều này cho thấy việc xác định đặc tính trước thử nghiệm được chú trọng hơn nhiều.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Trong cùng điều kiện với thử nghiệm chính thức, thiết lập một số nhóm nồng độ cách xa nhau để xác định nồng độ thấp nhất gây chết 100% và nồng độ cao nhất gây chết 0% số giun đất. Nồng độ thử nghiệm chính thức phải nằm trong khoảng này.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Thiết lập nhóm xử lý theo cấp số nhân. Thực hiện thử nghiệm xác định khoảng nồng độ trong cùng điều kiện với thử nghiệm chính thức để xác định khoảng nồng độ cho thử nghiệm chính thức. Không cần lần lặp ở thử nghiệm xác định khoảng, đơn giản hóa giai đoạn sơ bộ.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Đặt nồng độ giới hạn trên là 100 mg a.i./kg đất khô (a.i. là hoạt chất). Nếu không ghi nhận giun chết, không cần thử thêm.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Đặt nồng độ giới hạn trên là 1,000 mg chất thử/kg đất khô, tức một nghìn mg. Nếu tỷ lệ giun chết không lớn hơn 10%, không cần thử nghiệm chính thức. Ngưỡng cao hơn giảm thử nghiệm không cần thiết đối với chất độc tính thấp.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Đặt 5 đến 7 nhóm nồng độ trong khoảng xác định từ thử nghiệm sơ bộ, thêm một nhóm đối chứng không xử lý. Nếu dùng dung môi hữu cơ, phải thêm đối chứng dung môi. Mỗi nhóm nồng độ có 3 lần lặp.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Dựa trên kết quả sơ bộ hoặc dữ liệu độc tính đã biết, thiết lập 5 đến 7 nồng độ xử lý theo cấp số nhân, có nhóm đối chứng không xử lý và đối chứng dung môi nếu áp dụng. Mỗi nhóm phải có 4 lần lặp (tăng từ 3), mỗi lần lặp có 10 giun đất.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Không có (không quy định quy trình chuẩn bị cụ thể).

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Trước thử nghiệm, giun thử phải được giữ trong đất nhân tạo 24 giờ ở cùng điều kiện với thử nghiệm chính thức. Rửa sạch giun, dùng giấy lọc thấm khô trước khi cân. Bước thích nghi này giúp tăng tính nhất quán.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Cho 500 g đất vào bình thủy tinh (độ sâu đất ≥ 8 cm). Thêm dung dịch chất thử, trộn đều. Nếu dùng dung môi hữu cơ, phải để bay hơi hoàn toàn. Điều chỉnh độ ẩm đất bằng 30%–35% khối lượng đất khô. Với chất ít tan trong nước, có thể dùng lượng nhỏ dung môi hữu cơ (≤ 0.1 mL(g)/L).

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Quy định ba cách đưa chất thử vào đất theo độ tan:

   (1) Với chất thử tan trong nước: pha dung dịch thử bằng nước, trộn đều với đất nhân tạo.
   (2) Với chất tan trong dung môi hữu cơ: hòa tan trong n-hexane hoặc acetone, nhỏ từng giọt vào 10 g cát thạch anh. Sau khi dung môi bay hơi hoàn toàn, trộn với đất nhân tạo đã làm ẩm trước, thêm nước khử ion để đạt khối lượng ướt 750 g.
   (3) Với các chất không tan trong cả nước lẫn dung môi hữu cơ: trộn với cát thạch anh để tổng khối lượng đạt 10 g, sau đó trộn với đất nhân tạo đã làm ẩm trước, thêm nước khử ion để đạt khối lượng ướt 750 g.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Cho 500 g đất vào bình thủy tinh (độ sâu đất ≥ 8 cm).

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Cho 750 g đất nhân tạo đã xử lý theo khối lượng ướt vào bình thủy tinh, độ sâu đất không dưới 8 cm. Quy định «khối lượng ướt» thay phép đo trước đây dựa trên khối lượng khô.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Cân một lần lúc bắt đầu thử nghiệm — khối lượng cơ thể từ 0.30 g đến 0.60 g.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Cân hai lần: lúc bắt đầu thử nghiệm (khối lượng từ 0.30 g đến 0.60 g), và lúc kết thúc đối với giun sống sót. 

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Thêm nước khử ion để điều chỉnh độ ẩm đất bằng 30%–35% khối lượng đất khô.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Nếu cần, thêm nước để điều chỉnh độ ẩm đất khoảng 35% khối lượng đất khô. Hàm lượng nước trong đất phải được xác định theo NY/T 52, thiết lập phương pháp đo chuẩn hóa.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Thử nghiệm kéo dài hai tuần. Vào ngày 7 và ngày 14, đổ đất ra, quan sát và ghi triệu chứng nhiễm độc cùng số giun chết (chạm kim vào đầu sau; không phản ứng = chết), loại giun chết ngay. Tính LC50 và giới hạn tin cậy 95% theo tỷ lệ chết ngày 7 và ngày 14.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Thời gian thử nghiệm vẫn là 14 ngày. Các điểm hoàn thiện chính gồm:
   - Chiếu sáng liên tục để bảo đảm giun ở lại trong đất nhân tạo.
   - Bổ sung nước định kỳ bằng cân khối lượng để duy trì độ ẩm đất.
   - Cách quan sát: Nhẹ nhàng đổ đất lên đĩa thủy tinh hoặc đĩa; nhặt giun ra kiểm tra.
   - Tiêu chí xác định chết: Giun được coi là chết khi đầu trước không phản ứng với kích thích cơ học (thay cho đầu sau trước đây).
   - Sau kiểm tra ngày 7, cho giun sống sót và đất nhân tạo trở lại bình để tiếp tục thử nghiệm.
   - Khi kết thúc thử nghiệm, cân giun sống sót và xác định hàm lượng nước trong đất nhân tạo.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): LC50 và giới hạn tin cậy 95% cho mỗi thời điểm quan sát có thể tính bằng phương pháp Spearman-Kärber, nội suy tuyến tính hoặc đồ thị phân tích probit. Có thể dùng phần mềm tính dữ liệu độc tính phù hợp.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Chọn phương pháp thống kê như probit hoặc hồi quy logistic để tính LC50 và khoảng tin cậy 95% (trừ thử nghiệm giới hạn). Có thể dùng phần mềm thống kê phù hợp. Khi tỷ lệ chết là 0% và 100% ở hai nồng độ liên tiếp có công bội ≤ 2.0, phải lấy trung bình nhân của chúng làm LC50. Hướng dẫn này làm rõ thống kê và loại bỏ mơ hồ ở trường hợp biên.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Tỷ lệ chết trong nhóm đối chứng không xử lý không được vượt quá 10%.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Tỷ lệ chết trong nhóm đối chứng không xử lý và nhóm đối chứng dung môi không được vượt quá 10%. Việc nêu rõ đối chứng dung môi trong tiêu chí QC bảo đảm giám sát đúng tác động liên quan đến dung môi.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Yêu cầu báo cáo cơ bản.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Nội dung báo cáo chi tiết và chuẩn hóa hơn, gồm điều kiện thử nghiệm, dữ liệu thô, phương pháp thống kê và thông số chất lượng bổ sung. Điều này phù hợp thực hành GLP quốc tế và tăng minh bạch dữ liệu.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Phụ lục A quy định thành phần và tỷ lệ đất nhân tạo.

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Bổ sung cách chuẩn bị đất nhân tạo bên cạnh thành phần và tỷ lệ, cung cấp quy trình từng bước đầy đủ để phòng thí nghiệm chuẩn bị đất nhất quán.

Phiên bản cũ (GB/T 31270.15-2014): Phụ lục B quy định bốn mức độc tính theo LC50 (14d) / (mg a.i./kg đất khô):

• Cực độc: LC50 ≤ 0.1

• Độc cao: 0.1 < LC50 ≤ 1.0

• Độc vừa: 1.0 < LC50 ≤ 10

• Độc nhẹ: LC50 > 10

Phiên bản mới (GB/T 31270.15-2025): Bỏ phụ lục phân loại độc tính.