Comparaison entre les nouvelles et les anciennes lignes directrices pour l’essai de toxicité aiguë sur les vers de terre

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Ne s’applique pas aux pesticides chimiques volatils et peu solubles.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Ne s’applique pas aux pesticides volatils. La restriction relative aux substances « peu solubles » a été supprimée, ce qui élargit le champ des substances pouvant être soumises à l’essai.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Aucune.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Ajout d’un chapitre 2 dédié aux références normatives, citant des normes d’appui essentielles, notamment GB/T 6682 (eau destinée à l’usage en laboratoire d’analyse), NY/T 52 (détermination des sols), NY/T 1121.2 (détermination du pH des sols) et NY/T 4195.8 (élevage d’organismes destinés aux essais biologiques).

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Incluait les définitions du clitellum, du ver de terre adulte, de la concentration létale médiane, de la substance d’essai et du pesticide chimique.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Supprime les définitions du clitellum, du ver de terre adulte, de la substance d’essai et du pesticide chimique. Ne conserve que le terme essentiel : concentration létale médiane (LC50).

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Température : 20 °C ± 2 °C ; humidité relative : de 70% à 90% ; intensité lumineuse : de 400 lx à 800 lx.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Supprime l’exigence relative à l’humidité pendant l’essai, ce qui accroît la flexibilité opérationnelle. La température reste de 20 °C ± 2 °C et l’intensité lumineuse reste comprise entre 400 lx et 800 lx.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Aucun.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Ajout d’une liste détaillée de réactifs comprenant l’acétone, le n-hexane, le sable de quartz, l’argile kaolinique, le carbonate de calcium, le chloroacétamide et d’autres produits, fournissant des indications claires sur les substances chimiques et matériaux requis.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Il était recommandé de sélectionner des adultes Désignation : Eisenia fetida pour l’essai, avec un poids corporel compris entre 0.30 g et 0.60 g.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Impose l’utilisation de Désignation : Eisenia fetida. Des vers de terre adultes sains âgés de plus de 2 mois, présentant un clitellum développé (sexuellement matures) et un poids corporel compris entre 300 mg et 600 mg, doivent être utilisés. L’élevage de Désignation : Eisenia fetida doit être conforme à la norme NY/T 4195.8, afin de garantir des conditions d’élevage standardisées.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Ne répertoriait que les principaux appareils : incubateur, récipients en verre et fioles jaugées.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Fournit une liste complète des équipements avec des spécifications de précision : boîtes de cristallisation ou béchers, enceintes climatiques ou salles à température constante, équipements de mélange ou d’homogénéisation, balances électroniques (résolution : 0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g), balances électroniques (résolution : 0.1 g), thermo-hygromètre ou enregistreurs de température et d’humidité, pH-mètre, étuve et luxmètre.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : La substance d’essai devait être une formulation pesticide, une matière technique ou une substance pure. Pour les substances peu solubles dans l’eau, une petite quantité de solvant organique peu toxique pour les vers de terre pouvait être utilisée comme solvant auxiliaire, la quantité ne devant généralement pas dépasser 0.1 mL(g)/L.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : La substance d’essai doit être une matière technique (concentré technique), une formulation ou une substance pure. Avant l’essai, il convient d’obtenir des informations sur la solubilité de la substance d’essai dans l’eau et les solvants organiques, sa stabilité dans l’eau et le sol, sa stabilité à la photolyse, sa pression de vapeur saturante, sa pureté, son coefficient de partage n-octanol/eau et les résultats de l’essai de biodégradabilité facile. Cela témoigne d’un accent nettement plus marqué sur la caractérisation préalable à l’essai.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Dans les mêmes conditions que l’essai définitif, définir plusieurs groupes de concentration largement espacés afin de déterminer la concentration minimale provoquant 100% mortalité et la concentration maximale provoquant 0% mortalité des vers de terre. Les concentrations de l’essai définitif doivent être définies dans cette plage.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Définir les groupes de traitement selon une série géométrique. Réaliser l’essai exploratoire dans les mêmes conditions que l’essai définitif afin de déterminer la plage de concentrations de l’essai définitif. Les répétitions ne sont pas requises pour l’essai exploratoire, ce qui simplifie la phase d’essai préliminaire.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Fixer la concentration limite supérieure à 100 mg de substance active/kg de sol sec. Si aucune mortalité des vers de terre n’est observée, aucun essai supplémentaire n’est requis.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Fixer la concentration limite supérieure à 1,000 mg de substance d’essai/kg de sol sec. Si le taux de mortalité des vers de terre n’est pas supérieur à 10%, aucun essai définitif n’est requis. Ce seuil plus élevé réduit les essais inutiles pour les substances faiblement toxiques.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Définir 5 à 7 groupes de concentration dans la plage déterminée par l’essai exploratoire, ainsi qu’un groupe témoin non traité. Si un solvant organique est utilisé, un groupe témoin avec solvant doit également être ajouté. 3 répétitions pour chaque groupe de concentration.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Sur la base des résultats de l’essai exploratoire ou des données de toxicité connues, définir 5 à 7 concentrations de traitement selon une série géométrique, avec un groupe témoin non traité et, le cas échéant, un groupe témoin avec solvant. Chaque groupe doit comporter 4 répétitions (contre 3 auparavant), avec 10 vers de terre placés dans chaque répétition.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Aucune (aucune procédure de préparation spécifique n’est spécifiée).

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Avant l’essai, les vers de terre d’essai doivent être maintenus dans un sol artificiel pendant 24 heures, dans les mêmes conditions que l’essai définitif. Laver soigneusement les vers de terre et les sécher en les tamponnant avec du papier filtre avant de les peser. Cette étape d’acclimatation améliore la cohérence de l’essai.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Placer 500 g de sol dans un récipient en verre (profondeur du sol ≥ 8 cm). Ajouter la solution de la substance d’essai et mélanger soigneusement. Si un solvant organique est utilisé, il doit être complètement évaporé. Ajuster l’humidité du sol à 30%–35% de la masse du sol sec. Pour les substances peu solubles dans l’eau, une petite quantité de solvant organique (≤ 0.1 mL(g)/L) peut être utilisée.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Prévoit trois modes d’application distincts selon la solubilité :

   (1) Pour les substances d’essai solubles dans l’eau : préparer la solution d’essai avec de l’eau et la mélanger soigneusement au sol artificiel.
   (2) Pour les substances solubles dans les solvants organiques : dissoudre dans de l’n-hexane ou de l’acétone, puis ajouter goutte à goutte à 10 g de sable de quartz. Après évaporation complète du solvant, mélanger avec le sol artificiel préhumidifié, puis ajouter de l’eau déionisée jusqu’à atteindre 750 g de masse humide.
   (3) Pour les substances insolubles dans l’eau comme dans les solvants organiques: mélanger avec du sable de quartz jusqu’à une masse totale de 10 g, puis mélanger avec le sol artificiel préhumidifié et ajouter de l’eau déionisée jusqu’à atteindre 750 g de masse humide.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Placer 500 g de sol dans un récipient en verre (profondeur du sol ≥ 8 cm).

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Ajouter 750 g de sol artificiel traité, en masse humide, dans un récipient en verre, avec une profondeur de sol d’au moins 8 cm. La « masse humide » spécifiée remplace la mesure précédente fondée sur la masse sèche.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Pesée unique au début de l’essai — masse corporelle comprise entre 0.30 g et 0.60 g.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Peser deux fois : une fois au début de l’essai (masse corporelle comprise entre 0.30 g et 0.60 g), puis une fois à la fin de l’essai pour les vers de terre survivants. 

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Ajouter de l’eau déionisée pour ajuster l’humidité du sol à 30%–35% de la masse du sol sec.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Si nécessaire, ajouter de l’eau pour ajuster l’humidité du sol à environ 35% de la masse du sol sec. La teneur en humidité du sol doit être déterminée conformément à la norme NY/T 52, qui établit une méthode de mesure normalisée.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : L’essai dure deux semaines. Aux jours 7 et 14, verser le sol, observer et consigner les symptômes d’empoisonnement ainsi que les vers de terre morts (toucher l’extrémité postérieure avec une aiguille ; l’absence de réaction indique la mort), puis retirer immédiatement les vers de terre morts. Calculer la CL50 et les limites de confiance de 95% sur la base des taux de mortalité aux jours 7 et 14.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : La durée de l’essai reste de 14 jours. Les principales améliorations comprennent :
   - Éclairage continu afin de garantir que les vers de terre restent dans le sol artificiel.
   - Réapprovisionnement périodique en eau par pesée afin de maintenir l’humidité du sol.
   - Méthode d’observation : Verser délicatement le sol sur un plat ou une boîte de Pétri en verre ; retirer les vers de terre pour les examiner.
   - Critère de mortalité : Les vers de terre sont considérés comme morts lorsqu’ils ne présentent aucune réaction de l’ extrémité antérieure à un stimulus mécanique (au lieu de l’extrémité postérieure précédemment utilisée).
   - Après l’examen du jour 7, remettre les vers de terre survivants et le sol artificiel dans le récipient pour poursuivre l’essai.
   - À la fin de l’essai, peser les vers de terre survivants et déterminer la teneur en humidité du sol artificiel.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Les limites de confiance de la CL50 et de 95% pour chaque temps d’observation peuvent être calculées à l’aide de la méthode de Spearman-Kärber, de la méthode d’interpolation linéaire ou de la méthode graphique d’analyse par probits. Un logiciel approprié de calcul des données de toxicité peut également être utilisé.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Sélectionner des méthodes statistiques telles que la méthode des probits ou la méthode de régression logistique pour calculer la CL50 et son intervalle de confiance de 95% (à l’exception de l’essai limite). Un logiciel statistique approprié peut être utilisé. Lorsque les taux de mortalité sont 0% et 100% pour deux concentrations consécutives dont le rapport géométrique est ≤ 2.0, leur moyenne géométrique doit être utilisée comme CL50. Cette disposition fournit des orientations statistiques plus claires et élimine toute ambiguïté concernant les cas limites.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : La mortalité dans le groupe témoin non traité ne doit pas dépasser 10%.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : La mortalité dans le groupe témoin non traité et dans le groupe témoin avec solvant ne doit pas dépasser 10%. L’inclusion explicite du groupe témoin avec solvant dans les critères de contrôle qualité garantit que tout effet lié au solvant fait l’objet d’un suivi approprié.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : Exigences de base en matière de rapport.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Le contenu du rapport est plus détaillé et normalisé ; il couvre les conditions d’essai, les données brutes, les méthodes statistiques et des paramètres de qualité supplémentaires. Cela s’aligne sur les bonnes pratiques internationales de laboratoire (BPL) et améliore la transparence des données.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : L’annexe A fournissait les composants et les proportions du sol artificiel.

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : Ajout de la méthode de préparation du sol artificiel, en plus des composants et des proportions, fournissant un protocole complet étape par étape pour une préparation homogène du sol dans les différents laboratoires.

Ancienne version (GB/T 31270.15-2014) : L’annexe B spécifiait quatre niveaux de toxicité sur la base de la CL50 (14 j) / (mg de substance active/kg de sol sec) :

• Extrêmement toxique : CL50 ≤ 0.1

• Hautement toxique : 0.1 < CL50 ≤ 1.0

• Modérément toxique : 1.0 < CL50 ≤ 10

• Légèrement toxique : CL50 > 10

Nouvelle version (GB/T 31270.15-2025) : L’annexe relative à la classification de la toxicité a été supprimée.