Perbandingan Pedoman Baru dan Lama untuk Uji Toksisitas Akut pada Cacing Tanah

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Tidak berlaku untuk pestisida kimia yang mudah menguap dan yang sukar larut.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Tidak berlaku untuk pestisida yang mudah menguap. Pembatasan «sukar larut» dihapus, sehingga memperluas cakupan zat yang dapat diuji.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Tidak ada.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Ditambahkan Bab 2 khusus acuan normatif yang mencantumkan standar pendukung utama, termasuk GB/T 6682 (air untuk laboratorium analisis), NY/T 52 (penentuan pada tanah), NY/T 1121.2 (penentuan pH tanah), dan NY/T 4195.8 (pemeliharaan organisme uji biologis).

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Mencakup definisi klitelum, cacing tanah dewasa, konsentrasi letal median, zat uji, dan pestisida kimia.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Definisi klitelum, cacing tanah dewasa, zat uji, dan pestisida kimia dihapus. Hanya istilah utama yang dipertahankan: konsentrasi letal median (LC50).

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Suhu: 20°C ± 2°C; kelembapan relatif: 70% hingga 90%; intensitas cahaya: 400 lx hingga 800 lx.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Persyaratan kelembapan lingkungan pengujian dihapus untuk meningkatkan fleksibilitas operasional. Suhu tetap 20°C ± 2°C dan intensitas cahaya tetap 400 lx hingga 800 lx.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Tidak ada.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Ditambahkan daftar reagen terperinci, termasuk aseton, n-heksana, pasir kuarsa, lempung kaolin, kalsium karbonat, kloroasetamida, dan lainnya, sehingga memberi panduan jelas mengenai bahan kimia dan bahan yang diperlukan.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Disarankan memilih individu dewasa dari spesies Eisenia fetida untuk pengujian, dengan berat tubuh antara 0.30 g dan 0.60 g.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Menetapkan penggunaan spesies Eisenia fetida. Cacing tanah dewasa yang sehat, berumur lebih dari 2 bulan, dengan klitelum berkembang (matang seksual) dan berat tubuh antara 300 mg dan 600 mg harus digunakan. Pemeliharaan spesies Eisenia fetida harus mematuhi NY/T 4195.8, yang menyediakan kondisi pemeliharaan terstandar.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Hanya mencantumkan alat utama: inkubator, wadah kaca, dan labu ukur.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Menyediakan daftar peralatan lengkap dengan spesifikasi presisi: cawan kristalisasi atau gelas beker, ruang kendali lingkungan atau ruangan bersuhu konstan, peralatan pencampur, neraca elektronik (daya baca: 0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g), timbangan elektronik (daya baca: 0.1 g), termohigrometer atau pencatat suhu/kelembapan, pH meter, oven, dan lux meter.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Zat uji sebaiknya berupa formulasi pestisida, bahan teknis, atau zat murni. Untuk zat yang sukar larut dalam air, sedikit pelarut organik dengan toksisitas rendah terhadap cacing tanah dapat digunakan sebagai pelarut pembantu, umumnya tidak melebihi 0.1 mL(g)/L.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Zat uji harus berupa bahan teknis (konsentrat teknis), formulasi, atau zat murni. Sebelum pengujian, informasi mengenai kelarutan zat uji dalam air dan pelarut organik, stabilitas dalam air dan tanah, stabilitas fotolisis, tekanan uap jenuh, kemurnian, koefisien partisi n-oktanol/air, dan hasil uji kemudahan biodegradasi harus diperoleh. Hal ini mencerminkan penekanan yang jauh lebih besar pada karakterisasi sebelum pengujian.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Dalam kondisi yang sama dengan uji definitif, tetapkan beberapa kelompok konsentrasi dengan jarak lebar untuk menentukan konsentrasi minimum yang menyebabkan kematian 100% dan konsentrasi maksimum yang menyebabkan kematian 0% pada cacing tanah. Konsentrasi uji definitif harus ditetapkan dalam rentang ini.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Tetapkan kelompok perlakuan menggunakan deret geometri. Lakukan uji penentuan rentang dalam kondisi yang sama dengan uji definitif untuk menentukan rentang konsentrasi uji definitif. Ulangan tidak diperlukan pada uji penentuan rentang sehingga menyederhanakan tahap pengujian awal.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Tetapkan konsentrasi batas atas sebesar 100 mg a.i./kg tanah kering. Jika tidak ada kematian cacing tanah, pengujian lebih lanjut tidak diperlukan.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Tetapkan konsentrasi batas atas sebesar 1,000 mg zat uji/kg tanah kering (seribu miligram per kilogram). Jika tingkat kematian cacing tanah tidak lebih dari 10%, uji definitif tidak diperlukan. Ambang yang lebih tinggi mengurangi pengujian yang tidak perlu untuk zat bertoksisitas rendah.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Tetapkan 5 hingga 7 kelompok konsentrasi dalam rentang yang ditentukan pada uji penentuan rentang, ditambah satu kelompok kontrol tanpa perlakuan. Jika pelarut organik digunakan, kelompok kontrol pelarut juga harus ditambahkan. Setiap kelompok konsentrasi memiliki 3 ulangan.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Berdasarkan hasil uji penentuan rentang atau data toksisitas yang diketahui, tetapkan 5 hingga 7 konsentrasi perlakuan menggunakan deret geometri, dengan kontrol tanpa perlakuan dan, bila sesuai, kontrol pelarut. Setiap kelompok harus memiliki 4 ulangan (meningkat dari 3), dengan 10 cacing tanah pada setiap ulangan.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Tidak ada (tidak ditetapkan prosedur penyiapan khusus).

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Sebelum pengujian, cacing tanah uji harus dipelihara dalam tanah buatan selama 24 jam dalam kondisi yang sama dengan uji definitif. Cuci cacing hingga bersih dan keringkan dengan menyerap air menggunakan kertas saring sebelum ditimbang. Tahap aklimatisasi ini meningkatkan konsistensi pengujian.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Masukkan 500 g tanah ke dalam wadah kaca (kedalaman tanah ≥ 8 cm). Tambahkan larutan zat uji dan campur merata. Jika pelarut organik digunakan, pelarut harus diuapkan sepenuhnya. Sesuaikan kelembapan tanah menjadi 30%–35% dari berat tanah kering. Untuk zat yang sukar larut dalam air, sedikit pelarut organik (≤ 0.1 mL(g)/L) dapat digunakan.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Menyediakan tiga metode aplikasi berbeda berdasarkan kelarutan:

   (1) Untuk zat uji yang larut dalam air: siapkan larutan uji dengan air dan campurkan secara merata dengan tanah buatan.
   (2) Untuk zat uji yang larut dalam pelarut organik: larutkan dalam n-heksana atau aseton, lalu tambahkan tetes demi tetes ke 10 g pasir kuarsa. Setelah pelarut menguap sepenuhnya, campurkan dengan tanah buatan yang telah dibasahi sebelumnya, lalu tambahkan air deionisasi hingga mencapai berat basah 750 g.
   (3) Untuk zat yang tidak larut dalam air maupun pelarut organik: campurkan dengan pasir kuarsa hingga total 10 g, lalu campurkan dengan tanah buatan yang telah dibasahi sebelumnya dan tambahkan air deionisasi hingga berat basah 750 g.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Masukkan 500 g tanah ke dalam wadah kaca (kedalaman tanah ≥ 8 cm).

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Tambahkan 750 g tanah buatan yang telah diberi perlakuan berdasarkan berat basah ke dalam wadah kaca, dengan kedalaman tanah tidak kurang dari 8 cm. Ketentuan «berat basah» menggantikan pengukuran sebelumnya yang berdasarkan berat kering.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Timbang sekali pada awal pengujian — berat tubuh antara 0.30 g dan 0.60 g.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Timbang dua kali: sekali pada awal pengujian (berat tubuh antara 0.30 g dan 0.60 g) dan sekali pada akhir pengujian untuk cacing yang bertahan hidup. 

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Tambahkan air deionisasi untuk menyesuaikan kelembapan tanah menjadi 30%–35% dari berat tanah kering.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Jika perlu, tambahkan air untuk menyesuaikan kelembapan tanah menjadi sekitar 35% dari berat tanah kering. Kadar air tanah harus ditentukan sesuai NY/T 52, sehingga menetapkan metode pengukuran terstandar.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Pengujian berlangsung dua minggu. Pada hari 7 dan hari 14, keluarkan tanah, amati dan catat gejala keracunan serta cacing yang mati (sentuh ujung posterior dengan jarum; tidak ada respons = mati), lalu segera singkirkan cacing mati. Hitung LC50 dan batas kepercayaan 95% berdasarkan tingkat kematian pada hari 7 dan hari 14.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Masa pengujian tetap 14 hari. Penyempurnaan utama meliputi:
   - Cahaya terus-menerus disediakan agar cacing tetap berada dalam tanah buatan.
   - Penambahan air secara berkala melalui penimbangan untuk mempertahankan kelembapan tanah.
   - Metode pengamatan: Tuangkan tanah secara perlahan ke cawan atau piring kaca; ambil cacing untuk diperiksa.
   - Kriteria kematian: Cacing dianggap mati ketika tidak menunjukkan respons pada ujung anterior terhadap rangsangan mekanis (berubah dari ujung posterior).
   - Setelah pemeriksaan hari 7, cacing yang bertahan hidup dan tanah buatan dikembalikan ke wadah untuk melanjutkan pengujian.
   - Pada akhir pengujian, timbang cacing yang bertahan hidup dan tentukan kadar air tanah buatan.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): LC50 dan batas kepercayaan 95% untuk setiap waktu pengamatan dapat dihitung menggunakan metode Spearman-Kärber, interpolasi linier, atau metode grafik analisis probit. Perangkat lunak perhitungan data toksisitas yang sesuai juga dapat digunakan.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Pilih metode statistik seperti metode probit atau regresi logistik untuk menghitung LC50 dan interval kepercayaannya sebesar 95% (kecuali untuk uji batas). Perangkat lunak statistik yang sesuai dapat digunakan. Jika tingkat kematian adalah 0% dan 100% pada dua konsentrasi berurutan dengan rasio geometri ≤ 2.0, rata-rata geometrinya harus digunakan sebagai LC50. Hal ini memberi panduan statistik lebih jelas dan menghilangkan ambiguitas pada kasus batas.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Tingkat kematian dalam kelompok kontrol tanpa perlakuan tidak boleh melebihi 10%.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Tingkat kematian dalam kelompok kontrol tanpa perlakuan dan kelompok kontrol pelarut tidak boleh melebihi 10%. Pencantuman eksplisit kontrol pelarut dalam kriteria kendali mutu memastikan pengaruh terkait pelarut dipantau dengan tepat.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Persyaratan dasar pelaporan.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Isi laporan menjadi lebih terperinci dan terstandar, mencakup kondisi pengujian, data mentah, metode statistik, serta parameter mutu tambahan. Hal ini selaras dengan praktik GLP internasional dan meningkatkan transparansi data.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Lampiran A menyediakan komponen dan proporsi tanah buatan.

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Ditambahkan metode penyiapan tanah buatan, selain komponen dan proporsinya, sehingga menyediakan protokol lengkap langkah demi langkah untuk penyiapan tanah yang konsisten antarlaboratorium.

Versi Lama (GB/T 31270.15-2014): Lampiran B menetapkan empat tingkat toksisitas berdasarkan LC50 (14d) / (mg a.i./kg tanah kering):

• Toksisitas ekstrem: LC50 ≤ 0.1

• Toksisitas tinggi: 0.1 < LC50 ≤ 1.0

• Toksisitas sedang: 1.0 < LC50 ≤ 10

• Sedikit toksik: LC50 > 10

Versi Baru (GB/T 31270.15-2025): Lampiran klasifikasi toksisitas dihapus.