Vergleich zwischen den neuen und alten Leitlinien für den Akut-Toxizitätstest an Regenwürmern
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Um die wissenschaftliche Strenge der Bewertung der Umweltsicherheit von Pestiziden weiter zu erhöhen, wurde die nationale Norm GB/T 31270.15-2025 „Prüfrichtlinien für die Bewertung der Umweltsicherheit chemischer Pestizide – Teil 15: Akuter Toxizitätstest an Regenwürmern“ offiziell veröffentlicht und trat am 1. Mai 2026 in Kraft; sie ersetzt die vorherige Fassung 2014.
Diese Überarbeitung optimiert umfassend die Prüfbedingungen, Reagenzien und Materialien, die Datenverarbeitung sowie die Qualitätskontrolle. Die neue Fassung hebt die zwingende Vorgabe für die Prüffeuchte auf und erhöht dadurch die Flexibilität der Prüfung. Außerdem wurde ein Abschnitt zu normativen Verweisungen ergänzt und die Liste der Reagenzien und Geräte optimiert.
Hinweis von REACH24H
Unternehmen, die akute Toxizitätstests an Regenwürmern für die Registrierung von Pestiziden in China durchführen oder planen, müssen nun GB/T 31270.15-2025 einhalten, das am 1. Mai 2026 in Kraft trat. Nach der alten Methodik 2014 generierte Daten werden für neue Zulassungsanträge möglicherweise nicht mehr akzeptiert.
1. Anwendungsbereich, normative Verweisungen und Begriffsbestimmungen
Die Überarbeitung 2025 führt grundlegende strukturelle Änderungen an der Norm ein, darunter einen erweiterten Anwendungsbereich, neu aufgenommene normative Verweisungen und gestraffte Begriffsbestimmungen. Diese Änderungen schaffen einen robusteren und transparenteren Rahmen für das gesamte Prüfverfahren.
1.1 Anwendungsbereich
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Nicht anwendbar auf flüchtige und schwer wasserlösliche chemische Pestizide.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Nicht anwendbar auf flüchtige Pestizide. Die Einschränkung „schwer wasserlöslich“ wurde aufgehoben, wodurch der Anwendungsbereich der prüfbaren Stoffe erweitert wird.
1.2 Normative Verweisungen
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Keine.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Ein eigener Abschnitt 2 zu normativen Verweisungen wurde ergänzt, in dem wichtige unterstützende Normen angeführt werden, darunter GB/T 6682 (Wasser für den analytischen Laborgebrauch), NY/T 52 (Bodenbestimmung), NY/T 1121.2 (Bestimmung des Boden-pH-Werts) und NY/T 4195.8 (Kultivierung biologischer Testorganismen).
1.3 Begriffe und Definitionen
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Enthielt Definitionen für Clitellum, adulten Regenwurm, mediane letale Konzentration, Prüfsubstanz und chemisches Pestizid.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Die Definitionen für Clitellum, adulten Regenwurm, Prüfsubstanz und chemisches Pestizid wurden entfernt. Beibehalten wurde nur der Kernbegriff: mediane letale Konzentration (LC50).
2. Prüfbedingungen und Materialien
Die Fassung 2025 erweitert die Spezifikationen der für die Prüfung benötigten Materialien und Geräte erheblich und bietet Laboratorien klarere praktische Anleitungen, während unnötige Einschränkungen entfallen.
2.1 Prüfbedingungen
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Temperatur: 20°C ± 2°C; relative Luftfeuchte: 70% bis 90%; Lichtintensität: 400 lx bis 800 lx.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Die Anforderung an die Prüffeuchte wurde aufgehoben, wodurch die praktische Flexibilität erhöht wird. Die Temperatur bleibt bei 20°C ± 2°C und die Lichtintensität bei 400 lx bis 800 lx.
2.2 Reagenzien
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Keine.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Eine detaillierte Reagenzienliste wurde ergänzt, darunter Aceton, n-Hexan, Quarzsand, Kaolinton, Calciumcarbonat, Chloracetamid und weitere Stoffe, wodurch klare Vorgaben für die erforderlichen Chemikalien und Materialien geschaffen werden.
2.3 Testorganismus
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Es wurde empfohlen, adulte Bezeichnung: Eisenia fetida für die Prüfung auszuwählen, mit einem Körpergewicht zwischen 0.30 g und 0.60 g.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Die Verwendung von Bezeichnung: Eisenia fetida. wird vorgeschrieben. Es sind gesunde adulte Regenwürmer im Alter von über 2 Monaten mit entwickeltem Clitellum (geschlechtsreif) und einem Körpergewicht zwischen 300 mg und 600 mg zu verwenden. Die Kultivierung von Bezeichnung: Eisenia fetida muss NY/T 4195.8 entsprechen und standardisierte Haltungsbedingungen gewährleisten.
2.4 Apparate und Geräte
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Es wurden lediglich die wichtigsten Geräte aufgeführt: Inkubator, Glasgefäße und Messkolben.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Eine umfassende Geräteliste mit Präzisionsspezifikationen wird bereitgestellt: Kristallisierschalen oder Bechergläser, Klimakammern oder Räume mit konstanter Temperatur, Misch- oder Rührgeräte, elektronische Waagen (Ablesbarkeit: 0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g), elektronische Waagen (Ablesbarkeit: 0.1 g), Thermo-Hygrometer oder Temperatur-/Feuchteaufzeichnungsgeräte, pH-Meter, Trockenschrank und Luxmeter.
2.5 Prüfsubstanz
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Bei der Prüfsubstanz sollte es sich um Pestizidformulierungen, technische Wirkstoffe oder Reinstoffe handeln. Bei schwer wasserlöslichen Stoffen konnte eine geringe Menge eines für Regenwürmer wenig toxischen organischen Lösungsmittels als Hilfslösungsmittel verwendet werden; die Menge sollte im Allgemeinen 0.1 mL(g)/L nicht überschreiten.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Bei der Prüfsubstanz muss es sich um technische Wirkstoffe (technische Konzentrate), Formulierungen oder Reinstoffe handeln. Vor der Prüfung sollten Informationen zur Löslichkeit der Prüfsubstanz in Wasser und organischen Lösungsmitteln, zur Stabilität in Wasser und Boden, zur Photolyse-Stabilität, zum Sättigungsdampfdruck, zur Reinheit, zum n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten und zu den Ergebnissen des Tests auf leichte biologische Abbaubarkeit eingeholt werden. Dies spiegelt eine deutlich stärkere Betonung der Charakterisierung vor der Prüfung wider.
3. Prüfverfahren
Die Prüfverfahren wurden in der Norm 2025 am umfassendsten überarbeitet. Die wesentlichen Änderungen betreffen den Vorversuch zur Konzentrationsfindung, den Grenztest und nahezu alle Aspekte des endgültigen Tests – von der Festlegung der Konzentrationen und den Replikaten bis zur Bodenvorbereitung, dem Umgang mit den Organismen und den Beobachtungsprotokollen.
3.1 Vorversuch zur Konzentrationsfindung
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Unter denselben Bedingungen wie beim endgültigen Test werden mehrere Konzentrationsgruppen mit großen Abständen angesetzt, um die Mindestkonzentration zu bestimmen, die eine Mortalität von 100% Regenwürmern verursacht, sowie die Höchstkonzentration, die eine Mortalität von 0% Regenwürmern verursacht. Die Konzentrationen für den endgültigen Test sind innerhalb dieses Bereichs festzulegen.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Die Behandlungsgruppen werden nach einer geometrischen Reihe festgelegt. Der Vorversuch zur Konzentrationsfindung wird unter denselben Bedingungen wie der endgültige Test durchgeführt, um den Konzentrationsbereich für den endgültigen Test zu bestimmen. Für den Vorversuch sind keine Replikate erforderlich, wodurch die Phase der Vorprüfung vereinfacht wird.
3.2 Grenztest
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Die obere Grenzkonzentration wird auf 100 mg Wirkstoff/kg Trockenerde festgelegt. Wenn keine Mortalität der Regenwürmer beobachtet wird, sind keine weiteren Prüfungen erforderlich.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Die obere Grenzkonzentration wird auf 1,000 mg Prüfsubstanz/kg Trockenerde festgelegt. Wenn die Mortalitätsrate der Regenwürmer nicht höher als 10% ist, ist kein endgültiger Test erforderlich. Der höhere Schwellenwert verringert unnötige Prüfungen für Stoffe mit geringer Toxizität.
3.3 Endgültiger Test – Festlegung der Konzentrationen und Replikate
Alte Fassung (GB/T 31270.15-2014): Es werden 5 bis 7 Konzentrationsgruppen innerhalb des im Vorversuch bestimmten Bereichs sowie eine unbehandelte Kontrollgruppe angesetzt. Bei Verwendung eines organischen Lösungsmittels ist außerdem eine Lösungsmittel-Kontrollgruppe einzurichten. 3 Replikate für jede Konzentrationsgruppe.
Neue Fassung (GB/T 31270.15-2025): Auf Grundlage der Ergebnisse des Vorversuchs zur Konzentrationsfindung oder bekannter Toxizitätsdaten werden 5 bis 7 Behandlungskonzentrationen nach einer geometrischen Reihe festgelegt, mit einer unbehandelten Kontrollgruppe und gegebenenfalls einer Lösungsmittel-Kontrollgruppe. Jede Gruppe muss über 4 Replikate verfügen (gegenüber 3 zuvor), wobei in jedes Replikat 10 Regenwürmer eingesetzt werden.
3.4 Endgültiger Test – Vorbereitung des Testorganismus
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Keine (kein spezifisches Vorbereitungsverfahren angegeben).
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Vor dem Test sind die Testregenwürmer unter denselben Bedingungen wie beim definitiven Test 24 Stunden lang in künstlichem Boden zu halten. Waschen Sie die Regenwürmer sauber und tupfen Sie sie vor dem Wiegen mit Filterpapier trocken. Dieser Akklimatisierungsschritt verbessert die Konsistenz des Tests.
3.5 Definitiver Test — Applikationsmethode des Prüfstoffs
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Geben Sie 500 g Boden in einen Glasbehälter (Bodentiefe ≥ 8 cm). Geben Sie die Prüfstofflösung hinzu und mischen Sie gründlich. Bei Verwendung eines organischen Lösungsmittels muss dieses vollständig verdampft werden. Stellen Sie die Bodenfeuchte auf 30%–35% des Trockengewichts des Bodens ein. Für schlecht wasserlösliche Stoffe kann eine geringe Menge organischen Lösungsmittels (≤ 0.1 mL(g)/L) verwendet werden.
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Sie sieht je nach Löslichkeit drei verschiedene Applikationsmethoden vor:
(1) Für wasserlösliche Prüfstoffe: Bereiten Sie die Prüflösung mit Wasser vor und mischen Sie sie gründlich mit künstlichem Boden.
(2) Für in organischen Lösungsmitteln lösliche Stoffe: Lösen Sie sie in n-Hexan oder Aceton und geben Sie die Lösung tropfenweise auf 10 g Quarzsand. Nach vollständiger Verdampfung des Lösungsmittels mischen Sie den Sand mit vorbefeuchtetem künstlichem Boden und geben Sie deionisiertes Wasser hinzu, bis ein Nassgewicht von 750 g erreicht ist.
(3) Für Stoffe, die weder in Wasser noch in organischen Lösungsmitteln löslich sind: Mit Quarzsand auf insgesamt 10 g mischen, anschließend mit vorbefeuchtetem künstlichem Boden vermengen und deionisiertes Wasser bis zu einem Nassgewicht von 750 g hinzufügen.
3.6 Definitiver Test — Menge des künstlichen Bodens
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Geben Sie 500 g Boden in einen Glasbehälter (Bodentiefe ≥ 8 cm).
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Geben Sie 750 g Nassgewicht des behandelten künstlichen Bodens in einen Glasbehälter; die Bodentiefe darf 8 cm nicht unterschreiten. Das angegebene „Nassgewicht“ ersetzt die frühere Messung auf Grundlage des Trockengewichts.
3.7 Definitiver Test — Körpergewicht der Regenwürmer
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Einmal zu Beginn des Tests wiegen — Körpergewicht zwischen 0.30 g und 0.60 g.
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Zweimal wiegen: einmal zu Beginn des Tests (Körpergewicht zwischen 0.30 g und 0.60 g) und einmal am Ende des Tests bei den überlebenden Regenwürmern.
3.8 Definitiver Test — Bodenfeuchtegehalt
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Geben Sie deionisiertes Wasser hinzu, um die Bodenfeuchte auf 30%–35% des Trockengewichts des Bodens einzustellen.
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Falls erforderlich, geben Sie Wasser hinzu, um die Bodenfeuchte auf ungefähr 35% des Trockengewichts des Bodens einzustellen. Der Bodenfeuchtegehalt ist gemäß NY/T 52 zu bestimmen, wodurch eine standardisierte Messmethode festgelegt wird.
3.9 Definitiver Test — Inkubation und Beobachtung
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Der Test dauert zwei Wochen. An Tag 7 und Tag 14 wird der Boden ausgegossen, und Vergiftungssymptome sowie tote Regenwürmer werden beobachtet und aufgezeichnet (das hintere Ende mit einer Nadel berühren; keine Reaktion = tot); tote Regenwürmer sind unverzüglich zu entfernen. LC50 und die 95%-Konfidenzgrenzen werden auf Grundlage der Mortalitätsraten an Tag 7 und Tag 14 berechnet.
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Die Testdauer bleibt bei 14 Tagen. Zu den wesentlichen Präzisierungen gehören:
- Kontinuierliche Beleuchtung wird bereitgestellt, um sicherzustellen, dass die Regenwürmer im künstlichen Boden bleiben.
- Regelmäßiges Nachfüllen von Wasser durch Wiegen, um die Bodenfeuchte aufrechtzuerhalten.
- Beobachtungsmethode: Gießen Sie den Boden vorsichtig auf eine Glasschale oder einen Teller und nehmen Sie die Regenwürmer zur Untersuchung heraus.
- Todeskriterium: Regenwürmer gelten als tot, wenn sie auf einen mechanischen Reiz am vorderen Ende keine Reaktion zeigen (geändert vom hinteren Ende).
- Nach der Untersuchung am Tag 7 werden die überlebenden Regenwürmer und der künstliche Boden in den Behälter zurückgegeben, um den Test fortzusetzen.
- Am Ende des Tests werden die überlebenden Regenwürmer gewogen und der Feuchtegehalt des künstlichen Bodens bestimmt.
4. Statistische Methoden und Qualitätskontrolle
Die Version 2025 modernisiert den Rahmen für die statistische Analyse und verschärft die Anforderungen an die Qualitätskontrolle, wodurch zuverlässigere und reproduzierbarere Testergebnisse gewährleistet werden.
4.1 Statistische Methoden
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): LC50 und die 95%-Konfidenzgrenzen für jeden Beobachtungszeitpunkt können anhand der Spearman-Kärber-Methode, der linearen Interpolationsmethode oder der grafischen Probit-Analysemethode berechnet werden. Es kann auch eine geeignete Software zur Berechnung toxikologischer Daten verwendet werden.
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Wählen Sie statistische Methoden wie die Probit-Methode oder die logistische Regressionsmethode zur Berechnung der LC50 und ihres 95%-Konfidenzintervalls (außer beim Grenztest). Geeignete Statistiksoftware kann verwendet werden. Betragen die Mortalitätsraten bei zwei aufeinanderfolgenden Konzentrationen 0% und 100% und ist das geometrische Verhältnis ≤ 2.0, ist ihr geometrisches Mittel als LC50 zu verwenden. Dies bietet klarere statistische Leitlinien und beseitigt Unklarheiten bei Sonderfällen.
4.2 Qualitätskontrolle
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Die Mortalität in der unbehandelten Kontrollgruppe darf 10% nicht überschreiten.
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Die Mortalität in der unbehandelten Kontrollgruppe und der Lösungsmittel-Kontrollgruppe darf 10% nicht überschreiten. Die ausdrückliche Einbeziehung der Lösungsmittel-Kontrollgruppe in die QC-Kriterien stellt sicher, dass lösungsmittelbedingte Effekte ordnungsgemäß überwacht werden.
5. Prüfbericht und Anhänge
Der Standard 2025 erweitert die Anforderungen an die Berichterstattung erheblich und enthält wesentliche Änderungen an den Anhängen, einschließlich der Entfernung des Rahmens für die Toxizitätsklassifizierung.
5.1 Prüfbericht
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Grundlegende Anforderungen an die Berichterstattung.
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Die Berichtsinhalte sind detaillierter und stärker standardisiert und umfassen Testbedingungen, Rohdaten, statistische Methoden und zusätzliche Qualitätsparameter. Dies entspricht internationalen GLP-Verfahren und verbessert die Datentransparenz.
5.2 Vorbereitung von künstlichem Boden
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Anhang A enthielt die Komponenten und Mengenverhältnisse des künstlichen Bodens.
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Zusätzlich zu den Komponenten und Mengenverhältnissen wurde die Vorbereitungsmethode für künstlichen Boden ergänzt, einschließlich eines vollständigen Schritt-für-Schritt-Protokolls für eine einheitliche Bodenvorbereitung in allen Laboratorien.
5.3 Toxizitätsklassifizierung
Alte Version (GB/T 31270.15-2014): Anhang B legte auf Grundlage von LC50 (14 d) / (mg a. i./kg trockenem Boden) vier Toxizitätsstufen fest:
Extrem toxisch: LC50 ≤ 0.1
Hochtoxisch: 0.1 < LC50 ≤ 1.0
Mäßig toxisch: 1.0 < LC50 ≤ 10
Gering toxisch: LC50 > 10
Neue Version (GB/T 31270.15-2025): Der Anhang zur Toxizitätsklassifizierung wurde entfernt.
6. Zusammenfassung und Empfehlungen
Der Übergang von GB/T 31270.15-2014 zu GB/T 31270.15-2025 stellt eine umfassende Weiterentwicklung des Rahmens für akute Toxizitätstests an Regenwürmern dar. Zu den wichtigsten Verbesserungen gehören erweiterte normative Verweise, detailliertere Spezifikationen für Reagenzien und Geräte, verfeinerte Prüfverfahren mit mehreren Applikationsmethoden, eine höhere statistische Stringenz sowie robustere Kriterien für die Qualitätskontrolle.
Unternehmen, die akute Toxizitätstests an Regenwürmern für die Registrierung von Pestiziden in China durchführen oder in Auftrag geben, sollten die folgenden Maßnahmen priorisieren:
Prüfprotokolle aktualisieren — SOPs überarbeiten, um die neuen Applikationsmethoden, das Bodengewicht (750 g Nassgewicht), die Anforderungen an die Replikate (4 pro Gruppe) und die Beobachtungsverfahren zu berücksichtigen.
Ausrüstung aufrüsten — sicherstellen, dass die Waagen die vorgegebenen Anforderungen an die Ablesbarkeit erfüllen (0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g), und zusätzliche Geräte wie ein Luxmeter und ein pH-Messgerät anschaffen, sofern diese noch nicht vorhanden sind.
Neue statistische Methoden übernehmen — eine Probit- oder logistische Regressionsanalyse anstelle des älteren Spearman-Kärber-Verfahrens implementieren und die Berechnung des geometrischen Mittels für bestimmte Mortalitätsmuster vorbereiten.
Dokumentation der Berichterstattung verbessern — Prüfberichte an die neuen, umfassenderen Anforderungen an die Berichterstattung anpassen, einschließlich Rohdaten, Prüfbedingungen und statistischer Methoden.
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Da der im 1. Mai 2026 in Kraft getretene Termin inzwischen verstrichen ist, sollten Laboratorien und Pestizidregistranten, die ihre Methodenüberstellung noch nicht abgeschlossen haben, dies so bald wie möglich nachholen. Das agrochemische Compliance-Team von REACH24H kann bei der Überprüfung von Prüfprotokollen, der Bewertung der Laborqualifikation und der Unterstützung bei regulatorischen Einreichungen behilflich sein, um die Einhaltung der neuen Norm sicherzustellen.
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