Comparación entre las nuevas y antiguas directrices del ensayo de toxicidad aguda en lombrices de tierra

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): No aplicable a plaguicidas químicos volátiles ni poco solubles.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): No aplicable a plaguicidas volátiles. Se ha eliminado la restricción relativa a los «poco solubles», ampliando el conjunto de sustancias que pueden ensayarse.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Ninguna.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se añadió un capítulo 2 específico de referencias normativas, con normas de apoyo clave como GB/T 6682 (agua para uso en laboratorio analítico), NY/T 52 (determinación en suelo), NY/T 1121.2 (determinación del pH del suelo) y NY/T 4195.8 (cría de organismos para ensayos biológicos).

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Incluía definiciones de clitelo, lombriz adulta, concentración letal mediana, sustancia de ensayo y plaguicida químico.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se eliminaron las definiciones de clitelo, lombriz adulta, sustancia de ensayo y plaguicida químico. Solo se mantiene el término esencial: concentración letal mediana (LC50).

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Temperatura: 20°C ± 2°C; humedad relativa: del 70% al 90%; intensidad luminosa: de 400 lx a 800 lx.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se eliminó el requisito de humedad ambiental del ensayo, aumentando la flexibilidad operativa. La temperatura se mantiene en 20°C ± 2°C y la intensidad luminosa entre 400 lx y 800 lx.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Ninguna.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se añadió una lista detallada de reactivos que incluye acetona, n-hexano, arena de cuarzo, arcilla de caolín, carbonato de calcio, cloroacetamida y otros, con orientaciones claras sobre las sustancias químicas y los materiales necesarios.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Se recomendaba seleccionar ejemplares adultos de la especie Eisenia fetida para el ensayo, con un peso corporal de entre 0.30 g y 0.60 g.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se especifica el uso de la especie Eisenia fetida. Deben utilizarse lombrices adultas sanas de más de 2 meses de edad, con el clitelo desarrollado (madurez sexual) y un peso de entre 300 mg y 600 mg. La cría de la especie Eisenia fetida debe cumplir NY/T 4195.8, que proporciona condiciones de cría normalizadas.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Solo enumeraba los aparatos principales: incubadora, recipientes de vidrio y matraces aforados.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se proporciona una lista completa de equipos con especificaciones de precisión: cristalizadores o vasos de precipitados, cámaras ambientales o salas de temperatura constante, equipos de mezcla u homogeneización, balanzas electrónicas (resolución: 0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g), básculas electrónicas (resolución: 0.1 g), termohigrómetro o registradores de temperatura y humedad, medidor de pH, estufa y luxómetro.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): La sustancia de ensayo debía ser una formulación de plaguicida, un material técnico o una sustancia pura. Para las sustancias poco solubles en agua, podía utilizarse una pequeña cantidad de disolvente orgánico de baja toxicidad para las lombrices como disolvente auxiliar, generalmente sin superar 0.1 mL(g)/L.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): La sustancia de ensayo debe ser un material técnico (concentrado técnico), una formulación o una sustancia pura. Antes del ensayo deben obtenerse datos sobre su solubilidad en agua y disolventes orgánicos, estabilidad en agua y suelo, estabilidad frente a la fotólisis, presión de vapor saturado, pureza, coeficiente de reparto n-octanol/agua y resultados del ensayo de biodegradabilidad fácil. Esto refleja una atención mucho mayor a la caracterización previa al ensayo.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): En las mismas condiciones que el ensayo definitivo, se establecen varios grupos de concentración ampliamente separados para determinar la concentración mínima que causa una mortalidad del 100% y la máxima que causa una mortalidad del 0% en las lombrices. Las concentraciones del ensayo definitivo deben fijarse dentro de este intervalo.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se establecen los grupos de tratamiento mediante una serie geométrica. Se realiza el ensayo preliminar en las mismas condiciones que el definitivo para determinar el intervalo de concentraciones de este último. No se requieren réplicas en el ensayo preliminar, lo que simplifica la fase inicial.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Se fija la concentración límite superior en 100 mg a.i./kg de suelo seco. Si no se observa mortalidad en las lombrices, no se requieren más ensayos.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se fija la concentración límite superior en 1,000 mg de sustancia de ensayo/kg de suelo seco (mil miligramos por kilogramo). Si la mortalidad de las lombrices no supera el 10%, no se requiere un ensayo definitivo. El umbral más elevado reduce los ensayos innecesarios en sustancias de baja toxicidad.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Se establecen de 5 a 7 grupos de concentración dentro del intervalo determinado en el ensayo preliminar, además de un grupo de control sin tratar. Si se utiliza un disolvente orgánico, también debe añadirse un control del disolvente. Se realizan 3 réplicas por grupo de concentración.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Según los resultados preliminares o los datos de toxicidad conocidos, se establecen de 5 a 7 concentraciones de tratamiento mediante una serie geométrica, con un control sin tratar y, cuando proceda, un control del disolvente. Cada grupo debe tener 4 réplicas (frente a las 3 anteriores), con 10 lombrices en cada réplica.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Ninguna (no se especificaba un procedimiento de preparación).

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Antes del ensayo, las lombrices deben mantenerse durante 24 horas en suelo artificial, en las mismas condiciones que el ensayo definitivo. Deben lavarse y secarse por absorción con papel de filtro antes de pesarlas. Esta aclimatación mejora la uniformidad del ensayo.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Se colocan 500 g de suelo en un recipiente de vidrio (profundidad del suelo ≥ 8 cm). Se añade la solución de la sustancia de ensayo y se mezcla bien. Si se utiliza un disolvente orgánico, debe evaporarse por completo. Se ajusta la humedad del suelo al 30%–35% del peso del suelo seco. Para sustancias poco solubles en agua, podía utilizarse una pequeña cantidad de disolvente orgánico (≤ 0.1 mL(g)/L).

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se proporcionan tres métodos de aplicación según la solubilidad:

   (1) Para las sustancias solubles en agua: se prepara la solución de ensayo con agua y se mezcla bien con el suelo artificial.
   (2) Para las sustancias solubles en disolventes orgánicos: se disuelven en n-hexano o acetona y se añaden gota a gota a 10 g de arena de cuarzo. Tras evaporarse por completo el disolvente, se mezcla con suelo artificial previamente humedecido y se añade agua desionizada hasta alcanzar 750 g de peso húmedo.
   (3) Para las sustancias insolubles tanto en agua como en disolventes orgánicos: se mezclan con arena de cuarzo hasta un total de 10 g, después con suelo artificial previamente humedecido, y se añade agua desionizada hasta alcanzar 750 g de peso húmedo.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Se colocan 500 g de suelo en un recipiente de vidrio (profundidad del suelo ≥ 8 cm).

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se añaden 750 g de suelo artificial tratado, expresados en peso húmedo, a un recipiente de vidrio, con una profundidad del suelo no inferior a 8 cm. El «peso húmedo» especificado sustituye a la medición anterior basada en el peso seco.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Se pesan una vez al inicio del ensayo, con un peso corporal de entre 0.30 g y 0.60 g.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se pesan dos veces: al inicio del ensayo (peso corporal de entre 0.30 g y 0.60 g) y al final, en el caso de las lombrices supervivientes. 

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Se añade agua desionizada para ajustar la humedad del suelo al 30%–35% del peso del suelo seco.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Si es necesario, se añade agua para ajustar la humedad del suelo a aproximadamente el 35% del peso del suelo seco. El contenido de humedad debe determinarse conforme a NY/T 52, estableciendo un método de medición normalizado.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): El ensayo dura dos semanas. Los días 7 y 14 se vierte el suelo, se observan y registran los síntomas de intoxicación y las lombrices muertas (se toca el extremo posterior con una aguja; sin respuesta = muerte), y se retiran inmediatamente las muertas. Se calculan la LC50 y los límites de confianza del 95% a partir de las tasas de mortalidad de los días 7 y 14.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): El período de ensayo sigue siendo de 14 días. Las mejoras principales incluyen:
   - Luz continua para garantizar que las lombrices permanezcan en el suelo artificial.
   - Reposición periódica de agua mediante pesadas para mantener la humedad del suelo.
   - Método de observación: Se vierte suavemente el suelo sobre una placa o un plato de vidrio y se extraen las lombrices para examinarlas.
   - Criterio de muerte: Las lombrices se consideran muertas cuando no presentan respuesta del extremo anterior ante un estímulo mecánico (antes se utilizaba el extremo posterior).
   - Tras el examen del día 7, las lombrices supervivientes y el suelo artificial se devuelven al recipiente para continuar.
   - Al finalizar el ensayo, se pesan las lombrices supervivientes y se determina el contenido de humedad del suelo artificial.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): La LC50 y los límites de confianza del 95% para cada momento de observación pueden calcularse mediante el método de Spearman-Kärber, interpolación lineal o el método gráfico de análisis probit. También puede utilizarse software adecuado para calcular datos de toxicidad.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se seleccionan métodos estadísticos como probit o regresión logística para calcular la LC50 y su intervalo de confianza del 95% (salvo en el ensayo límite). Puede utilizarse software estadístico adecuado. Cuando las tasas de mortalidad son del 0% y del 100% en dos concentraciones consecutivas con una razón geométrica ≤ 2.0, debe utilizarse su media geométrica como LC50. Esto aporta orientaciones estadísticas más claras y elimina la ambigüedad en casos límite.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): La mortalidad del grupo de control sin tratar no debe superar el 10%.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): La mortalidad del grupo de control sin tratar y del control del disolvente no debe superar el 10%. La inclusión expresa del control del disolvente en los criterios de calidad garantiza una vigilancia adecuada de los efectos relacionados con el disolvente.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): Requisitos básicos de presentación de informes.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): El contenido del informe es más detallado y normalizado e incluye condiciones de ensayo, datos brutos, métodos estadísticos y parámetros de calidad adicionales. Esto se ajusta a las prácticas internacionales de BPL y mejora la transparencia de los datos.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): El anexo A proporcionaba los componentes y proporciones del suelo artificial.

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se añadió el método de preparación del suelo artificial, además de sus componentes y proporciones, ofreciendo un protocolo completo paso a paso para una preparación uniforme entre laboratorios.

Versión antigua (GB/T 31270.15-2014): El anexo B especificaba cuatro niveles de toxicidad según LC50 (14d) / (mg a.i./kg de suelo seco):

• Extremadamente tóxico: LC50 ≤ 0.1

• Altamente tóxico: 0.1 < LC50 ≤ 1.0

• Moderadamente tóxico: 1.0 < LC50 ≤ 10

• Ligeramente tóxico: LC50 > 10

Versión nueva (GB/T 31270.15-2025): Se eliminó el anexo de clasificación de toxicidad.