Comparação entre as novas e as antigas orientações do ensaio de toxicidade aguda em minhocas
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Para reforçar o rigor científico da avaliação da segurança ambiental dos pesticidas, foi oficialmente publicada a norma nacional GB/T 31270.15-2025 «Orientações de ensaio para a avaliação da segurança ambiental dos pesticidas químicos — Parte 15: Ensaio de toxicidade aguda em minhocas», que entrou em vigor em 1 de maio de 2026 e substituiu a versão anterior de 2014.
Esta revisão otimiza de forma abrangente as condições de ensaio, os reagentes e materiais, o tratamento de dados e o controlo de qualidade. A nova versão elimina o requisito rígido de humidade ambiental do ensaio, aumentando a flexibilidade. Acrescenta também uma secção de referências normativas e otimiza a lista de reagentes e equipamentos.
Lembrete da REACH24H
As empresas que realizam ou planeiam realizar ensaios de toxicidade aguda em minhocas para o registo de pesticidas na China devem agora cumprir a GB/T 31270.15-2025, que entrou em vigor em 1 de maio de 2026. Os dados gerados com a metodologia antiga de 2014 poderão deixar de ser aceites em novas submissões regulamentares.
1. Âmbito, referências normativas e definições
A revisão de 2025 introduz alterações estruturais fundamentais na norma, incluindo o alargamento do âmbito de aplicação, novas referências normativas e a simplificação das definições terminológicas. Estas alterações estabelecem um quadro mais sólido e transparente para todo o procedimento de ensaio.
1.1 Âmbito
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Não aplicável a pesticidas químicos voláteis nem pouco solúveis.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Não aplicável a pesticidas voláteis. A restrição relativa aos «pouco solúveis» foi eliminada, alargando o conjunto de substâncias que podem ser ensaiadas.
1.2 Referências normativas
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Nenhuma.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Foi acrescentado um capítulo 2 dedicado às referências normativas, citando normas de apoio fundamentais, incluindo GB/T 6682 (água para utilização em laboratório analítico), NY/T 52 (determinação no solo), NY/T 1121.2 (determinação do pH do solo) e NY/T 4195.8 (criação de organismos para ensaios biológicos).
1.3 Termos e definições
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Incluía definições de clitelo, minhoca adulta, concentração letal mediana, substância de ensaio e pesticida químico.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Foram eliminadas as definições de clitelo, minhoca adulta, substância de ensaio e pesticida químico. Mantém-se apenas o termo essencial: concentração letal mediana (LC50).
2. Condições de ensaio e materiais
A versão de 2025 alarga significativamente as especificações dos materiais e equipamentos necessários ao ensaio, dando aos laboratórios orientações operacionais mais claras e eliminando restrições desnecessárias.
2.1 Condições de ensaio
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Temperatura: 20°C ± 2°C; humidade relativa: 70% a 90%; intensidade luminosa: 400 lx a 800 lx.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Foi eliminado o requisito de humidade ambiental do ensaio, aumentando a flexibilidade operacional. A temperatura mantém-se em 20°C ± 2°C e a intensidade luminosa entre 400 lx e 800 lx.
2.2 Reagentes
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Nenhuma.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Foi acrescentada uma lista detalhada de reagentes, incluindo acetona, n-hexano, areia de quartzo, argila de caulino, carbonato de cálcio, cloroacetamida e outros, com orientações claras sobre os produtos químicos e materiais necessários.
2.3 Organismo de ensaio
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Recomendava-se selecionar exemplares adultos da espécie Eisenia fetida para o ensaio, com peso corporal entre 0.30 g e 0.60 g.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Especifica-se a utilização da espécie Eisenia fetida. Devem ser utilizadas minhocas adultas saudáveis com mais de 2 meses de idade, clitelo desenvolvido (maturidade sexual) e peso corporal entre 300 mg e 600 mg. A criação da espécie Eisenia fetida deve cumprir a NY/T 4195.8, que estabelece condições de criação normalizadas.
2.4 Aparelhos e equipamentos
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Enumerava apenas os principais aparelhos: incubadora, recipientes de vidro e balões volumétricos.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): É apresentada uma lista completa de equipamentos com especificações de precisão: cristalizadores ou copos de precipitação, câmaras ambientais ou salas de temperatura constante, equipamentos de mistura ou homogeneização, balanças eletrónicas (resolução: 0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g), balanças eletrónicas de menor resolução (0.1 g), termohigrómetro ou registadores de temperatura e humidade, medidor de pH, estufa e luxímetro.
2.5 Substância de ensaio
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): A substância de ensaio devia ser uma formulação de pesticida, um material técnico ou uma substância pura. Para substâncias pouco solúveis em água, podia utilizar-se uma pequena quantidade de solvente orgânico com baixa toxicidade para minhocas como solvente auxiliar, geralmente não superior a 0.1 mL(g)/L.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): A substância de ensaio deve ser um material técnico (concentrado técnico), uma formulação ou uma substância pura. Antes do ensaio, devem obter-se informações sobre a sua solubilidade em água e solventes orgânicos, estabilidade em água e solo, estabilidade à fotólise, pressão de vapor saturado, pureza, coeficiente de partição n-octanol/água e resultados do ensaio de biodegradabilidade fácil. Isto reflete uma atenção muito maior à caracterização prévia ao ensaio.
3. Procedimentos de ensaio
Os procedimentos de ensaio sofreram as revisões mais substanciais da norma de 2025. As principais alterações abrangem o ensaio de determinação do intervalo, o ensaio-limite e quase todos os aspetos do ensaio definitivo, desde a definição de concentrações e réplicas até à preparação do solo, ao manuseamento dos organismos e aos protocolos de observação.
3.1 Ensaio de determinação do intervalo
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Nas mesmas condições do ensaio definitivo, estabelecem-se vários grupos de concentração com intervalos amplos para determinar a concentração mínima que causa 100% de mortalidade e a máxima que causa 0% de mortalidade nas minhocas. As concentrações do ensaio definitivo devem ser definidas dentro deste intervalo.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Estabelecem-se os grupos de tratamento utilizando uma série geométrica. Realiza-se o ensaio de determinação do intervalo nas mesmas condições do ensaio definitivo para determinar o intervalo de concentrações deste último. Não são necessárias réplicas no ensaio de determinação do intervalo, simplificando a fase preliminar.
3.2 Ensaio-limite
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Define-se a concentração-limite superior em 100 mg a.i./kg de solo seco. Se não for observada mortalidade nas minhocas, não são necessários ensaios adicionais.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Define-se a concentração-limite superior em 1,000 mg de substância de ensaio/kg de solo seco (mil miligramas por quilograma). Se a mortalidade das minhocas não for superior a 10%, não é necessário um ensaio definitivo. O limiar mais elevado reduz ensaios desnecessários para substâncias de baixa toxicidade.
3.3 Ensaio definitivo — concentrações e réplicas
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Estabelecem-se 5 a 7 grupos de concentração dentro do intervalo determinado no ensaio preliminar, mais um grupo de controlo não tratado. Se for utilizado um solvente orgânico, deve também acrescentar-se um controlo de solvente. São realizadas 3 réplicas para cada grupo de concentração.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Com base nos resultados preliminares ou em dados de toxicidade conhecidos, estabelecem-se 5 a 7 concentrações de tratamento utilizando uma série geométrica, com um controlo não tratado e, quando aplicável, um controlo de solvente. Cada grupo deve ter 4 réplicas (em vez das 3 anteriores), com 10 minhocas em cada réplica.
3.4 Ensaio definitivo — preparação dos organismos
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Nenhuma (não era especificado um procedimento de preparação).
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Antes do ensaio, as minhocas devem permanecer durante 24 horas em solo artificial, nas mesmas condições do ensaio definitivo. Devem ser lavadas e secas por absorção com papel de filtro antes da pesagem. Esta aclimatação melhora a consistência do ensaio.
3.5 Ensaio definitivo — método de aplicação da substância
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Colocam-se 500 g de solo num recipiente de vidro (profundidade do solo ≥ 8 cm). Adiciona-se a solução da substância de ensaio e mistura-se bem. Se for utilizado um solvente orgânico, este deve evaporar completamente. Ajusta-se a humidade do solo para 30%–35% do peso do solo seco. Para substâncias pouco solúveis em água, podia utilizar-se uma pequena quantidade de solvente orgânico (≤ 0.1 mL(g)/L).
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): São apresentados três métodos de aplicação em função da solubilidade:
(1) Para as substâncias solúveis em água: prepara-se a solução de ensaio com água e mistura-se bem com o solo artificial.
(2) Para as substâncias solúveis em solventes orgânicos: dissolvem-se em n-hexano ou acetona e adicionam-se gota a gota a 10 g de areia de quartzo. Após a evaporação completa do solvente, mistura-se com solo artificial previamente humedecido e adiciona-se água desionizada até atingir 750 g de peso húmido.
(3) Para as substâncias insolúveis tanto em água como em solventes orgânicos: misturam-se com areia de quartzo até perfazer 10 g, depois com solo artificial previamente humedecido, e adiciona-se água desionizada até atingir 750 g de peso húmido.
3.6 Ensaio definitivo — peso do solo artificial
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Colocam-se 500 g de solo num recipiente de vidro (profundidade do solo ≥ 8 cm).
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Adicionam-se 750 g de solo artificial tratado, expressos em peso húmido, a um recipiente de vidro, com profundidade do solo não inferior a 8 cm. O «peso húmido» especificado substitui a medição anterior baseada no peso seco.
3.7 Ensaio definitivo — peso corporal das minhocas
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Pesam-se uma vez no início do ensaio, com peso corporal entre 0.30 g e 0.60 g.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Pesam-se duas vezes: no início do ensaio (peso corporal entre 0.30 g e 0.60 g) e no final, no caso das minhocas sobreviventes.
3.8 Ensaio definitivo — teor de humidade do solo
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Adiciona-se água desionizada para ajustar a humidade do solo para 30%–35% do peso do solo seco.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Se necessário, adiciona-se água para ajustar a humidade do solo para aproximadamente 35% do peso do solo seco. O teor de humidade deve ser determinado de acordo com a NY/T 52, estabelecendo um método de medição normalizado.
3.9 Ensaio definitivo — incubação e observação
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): O ensaio dura duas semanas. Nos dias 7 e 14, verte-se o solo, observam-se e registam-se sintomas de intoxicação e minhocas mortas (toca-se na extremidade posterior com uma agulha; ausência de resposta = morte), e retiram-se imediatamente as mortas. Calculam-se a LC50 e os limites de confiança de 95% com base nas taxas de mortalidade dos dias 7 e 14.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): O período de ensaio mantém-se em 14 dias. Os principais aperfeiçoamentos incluem:
- Luz contínua para garantir que as minhocas permanecem no solo artificial.
- Reposição periódica de água através de pesagens para manter a humidade do solo.
- Método de observação: Verte-se suavemente o solo para uma placa ou prato de vidro e retiram-se as minhocas para exame.
- Critério de morte: As minhocas são consideradas mortas quando não apresentam resposta da extremidade anterior a um estímulo mecânico (anteriormente utilizava-se a extremidade posterior).
- Após o exame do dia 7, as minhocas sobreviventes e o solo artificial regressam ao recipiente para continuar.
- No final do ensaio, pesam-se as minhocas sobreviventes e determina-se o teor de humidade do solo artificial.
4. Métodos estatísticos e controlo de qualidade
A versão de 2025 moderniza o quadro da análise estatística e reforça os requisitos de controlo de qualidade, garantindo resultados mais fiáveis e reprodutíveis.
4.1 Métodos estatísticos
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): A LC50 e os limites de confiança de 95% para cada momento de observação podem ser calculados pelo método de Spearman-Kärber, interpolação linear ou método gráfico de análise probit. Também pode ser utilizado software adequado ao cálculo de dados de toxicidade.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Selecionam-se métodos estatísticos como probit ou regressão logística para calcular a LC50 e o seu intervalo de confiança de 95% (exceto no ensaio-limite). Pode utilizar-se software estatístico adequado. Quando as taxas de mortalidade são 0% e 100% em duas concentrações consecutivas com razão geométrica ≤ 2.0, deve utilizar-se a sua média geométrica como LC50. Isto proporciona orientações estatísticas mais claras e elimina a ambiguidade em casos-limite.
4.2 Controlo de qualidade
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): A mortalidade no grupo de controlo não tratado não deve exceder 10%.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): A mortalidade no grupo de controlo não tratado e no controlo de solvente não deve exceder 10%. A inclusão explícita do controlo de solvente nos critérios de qualidade garante a monitorização adequada dos efeitos relacionados com o solvente.
5. Relatórios e anexos
A norma de 2025 reforça significativamente os requisitos dos relatórios e introduz alterações importantes nos anexos, incluindo a eliminação do quadro de classificação da toxicidade.
5.1 Relatório de ensaio
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): Requisitos básicos de apresentação de relatórios.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): O conteúdo do relatório é mais detalhado e normalizado, abrangendo condições de ensaio, dados brutos, métodos estatísticos e parâmetros adicionais de qualidade. Isto está alinhado com as práticas internacionais de BPL e melhora a transparência dos dados.
5.2 Preparação do solo artificial
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): O anexo A apresentava os componentes e as proporções do solo artificial.
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Foi acrescentado o método de preparação do solo artificial, além dos seus componentes e proporções, proporcionando um protocolo completo, passo a passo, para uma preparação consistente entre laboratórios.
5.3 Classificação da toxicidade
Versão antiga (GB/T 31270.15-2014): O anexo B especificava quatro níveis de toxicidade com base em LC50 (14d) / (mg a.i./kg de solo seco):
Extremamente tóxico: LC50 ≤ 0.1
Altamente tóxico: 0.1 < LC50 ≤ 1.0
Moderadamente tóxico: 1.0 < LC50 ≤ 10
Ligeiramente tóxico: LC50 > 10
Nova versão (GB/T 31270.15-2025): Foi eliminado o anexo relativo à classificação da toxicidade.
6. Resumo e recomendações
A transição da GB/T 31270.15-2014 para a GB/T 31270.15-2025 representa uma atualização abrangente do quadro do ensaio de toxicidade aguda em minhocas. As melhorias principais incluem mais referências normativas, especificações mais detalhadas de reagentes e equipamentos, procedimentos aperfeiçoados com vários métodos de aplicação, maior rigor estatístico e critérios de controlo de qualidade mais sólidos.
As empresas que realizam ou encomendam ensaios de toxicidade aguda em minhocas para o registo de pesticidas na China devem dar prioridade às seguintes ações:
Atualizar os protocolos de ensaio — rever os procedimentos operacionais normalizados para refletir os novos métodos de aplicação, o peso do solo (750 g de peso húmido), as réplicas exigidas (4 por grupo) e os procedimentos de observação.
Melhorar o equipamento — garantir que as balanças cumprem as resoluções especificadas (0.01 g, 0.001 g, 0.0001 g) e adquirir equipamento adicional, como um luxímetro e um medidor de pH, se ainda não estiver disponível.
Adotar novos métodos estatísticos — implementar análise probit ou regressão logística em substituição do anterior método de Spearman-Kärber e preparar o cálculo da média geométrica para padrões específicos de mortalidade.
Melhorar a documentação dos relatórios — alinhar os relatórios com os novos requisitos, mais completos, incluindo dados brutos, condições de ensaio e métodos estatísticos.
Precisa de ajuda para adotar a norma GB/T 31270.15-2025?
Após a entrada em vigor em 1 de maio de 2026, os laboratórios e requerentes do registo de pesticidas que ainda não concluíram a transição metodológica devem fazê-lo o mais rapidamente possível. A equipa de conformidade agroquímica da REACH24H pode ajudar na revisão dos protocolos, avaliação da qualificação dos laboratórios e apoio às submissões regulamentares para garantir a conformidade com a nova norma.
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Escrito por
REACH24H Agrochemical Compliance Team
REACH24H
A equipa de agroquímicos da REACH24H presta serviços integrados de conformidade regulamentar global a empresas de pesticidas, biopesticidas, biocidas, bioestimulantes e fertilizantes. Abrangemos mercados como a China, os EUA, a Europa, a Ásia-Pacífico e a América Latina e já prestámos serviços a mais de 600 empresas em todo o mundo, com uma cobertura superior a 90% entre as 100 maiores empresas de pesticidas da China.